ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7μm糖基分析專用柱的安裝使用

II. 入門指南

  每根ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7μm糖基分析專用柱均附帶一份分析證書和一張性能測試色譜圖。分析證書與每批填料相對應，其中包括批號以及填料的理化特性分析結(jié)果。粒徑和孔結(jié)構(gòu)均在鍵合之前進行分析。我們測量了鍵合的碳和氮含量以確保一致的覆蓋率，還通過沃特世糖基性能測試標準品(部件號186006349)的色譜分離效果對每批填料的選擇性進行了評估，該糖基性能測試標準品為Man-5和Man-6(來自人源IgG)加標的2-AB標記N-糖標準品混合物。IgG糖基的復雜混合物中含有高甘露糖結(jié)構(gòu)以及中性和酸性復雜結(jié)構(gòu)。我們使用所選組分的保留時間及保留時間差異對每批填料進行質(zhì)量控制測試。性能測試色譜圖為每根色譜柱所特有，含有以下信息：批號、色譜柱序列號、反壓、USP塔板數(shù)、折合塔板高度(RPH)、USP拖尾因子、保留因子(k')、峰寬和色譜條件。這些數(shù)據(jù)包含于每根色譜柱隨附的eCord?中，用戶應妥善保存，以備將來參考。

a. eCord安裝

  eCord按鈕應當安裝在柱溫箱模塊的側(cè)面。eCord按鈕經(jīng)過磁化處理，無需專門定位。

b. 色譜柱接頭

  ACQUITY UPLC、ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)所采用的管路和鍍金壓力螺母經(jīng)過專門設計，可達到嚴格容差水平并能最大限度減少系統(tǒng)擴散。

  對于ACQUITY UPLC系統(tǒng)，色譜柱應連接至具有色譜柱穩(wěn)定器的進樣器，色譜柱穩(wěn)定器有4種類型：

●205000291 50或100 mm色譜柱

●205000365 150 mm色譜柱

●205000489 HTCH 50或100 mm

●205000494 HTCH 150 mm

  前兩種部件適用于原柱溫箱，它們具有不同的管路布置，使150 mm色譜柱也可與VanGuard?預柱或在線過濾器配合使用，同時保持穩(wěn)定的溶劑溫度。后兩種部件適用于新

型高溫柱溫箱(HTCH)。ACQUITY UPLC系統(tǒng)可提供最佳的色譜柱入口管路。在管路的進樣閥端明確標識了藍色熱縮管標記。將管路的另一端插入ACQUITY UPLC色譜柱，并用兩個5/16 in扳手擰緊壓力接頭(或用手擰緊滾花螺母)。

  如果該色譜柱將用于ACQUITY UPLC H-Class或ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)，您只需將色譜柱通過鍍金手緊接頭連接至系統(tǒng)上的主動預加熱器即可。ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)上的色譜柱穩(wěn)定器僅有一種配置。

  有關(guān)接頭和連接管路的更多信息，請參閱ACQUITY UPLC、ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)操作員指南的相關(guān)部分。

c. 色譜柱安裝

  注：下述步驟給出的流速適用于填料粒徑1.7μm、內(nèi)徑2.1 mm的典型色譜柱。

1. 清除溶劑輸送系統(tǒng)中任何含有緩沖液或與水混溶的流動相，并將色譜柱的入口端連接至進樣器出口。色譜柱識別標記上的箭頭指示了正確的溶劑流向。

2. 通過將泵流速設置為0.1 mL/min，并且在3 min內(nèi)增加至0.25 mL/min，用100%有機流動相(乙腈)沖洗色譜柱。在10 min內(nèi)將水相增加至90%。請注意反壓。將水相比例降至起始條件(測試色譜圖中采用22%水相)。

3. 當流動相可從色譜柱出口自由流出時，停止液流并將色譜柱出口連接至檢測器。這樣可以防止空氣進入檢測系統(tǒng)，更快速地達到基線平衡。

4. 在3 min內(nèi)將流速從0.25 mL/min逐漸增加至0.5 mL/min。

5. 一旦反壓和基線達到穩(wěn)定狀態(tài)，即可繼續(xù)進行下一部分操作。

d. 色譜柱平衡

  糖基分析專用柱出廠時保存于100%乙腈中。在將色譜柱更換至其它流動相系統(tǒng)之前，務必要確保流動相的相容性。至少用10倍柱體積的流動相平衡色譜柱(參見表1中的色譜柱體積)。

  為了避免流動相緩沖液在色譜柱或系統(tǒng)中發(fā)生沉淀，使用5倍柱體積的水/有機溶劑混合物沖洗色譜柱，其中乙腈含量與所需緩沖液流動相中的乙腈含量相同或更高。例如，使用50%乙腈水溶液沖洗色譜柱和UPLC系統(tǒng)，然后再引入50%乙腈/50%緩沖液流動相。

  溶劑的級別和質(zhì)量對于糖基分析非常重要。我們強烈推薦僅使用LC-MS級試劑配制糖基分析流動相洗脫液。我們還強烈推薦使用沃特世甲酸銨溶液(部件號186007081)配制洗脫液A。沃特世甲酸銨溶液是由LC-MS級試劑制成的濃縮液，能夠減少帶有不（bu）良標記的糖基加合物的生成。

  色譜柱平衡可以先通過穩(wěn)定的壓力和穩(wěn)定的檢測器基線來進行判定。但是，對于特定的應用，則需要測試所需的平衡持續(xù)時間。充分平衡的標準包括主峰和次要峰保留時間的重現(xiàn)性、關(guān)鍵分析物對的分離度和一致的基線特性。

  注：低濃度流動相添加劑，尤其是那些具有最小緩沖容量的添加劑其梯度分析之間可能需要更長的平衡和再平衡時間。

e. 初始柱效測定

1. 將色譜柱用于所需應用前，需執(zhí)行柱效測試。沃特世推薦在收到色譜柱后使用“性能測試色譜圖”中所述的溶質(zhì)混合物和條件對色譜柱進行測試。這些條件記錄在安裝于色譜柱上的eCord中。

2. 測量被測化合物的保留情況和理論塔板數(shù)(N)。

3. 以預定的時間間隔進行重復測試，以跟蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。使用兩個不同的UPLC系統(tǒng)進行測試，所得柱效結(jié)果可能會有微小差異，這可能是由于連接質(zhì)量、運行環(huán)境、系統(tǒng)電子設備、試劑質(zhì)量、色譜柱條件和操作員技術(shù)等因素所致。

f: 新色譜柱活化

  良好的規(guī)范是在分析實際待測樣品之前，確保全新(之前未使用過的)BEH Amide, 130?糖基分析專用柱經(jīng)過良好的活化并可提供最佳性能。該過程可通過連續(xù)進樣代表性樣品直至獲得穩(wěn)定的色譜圖來完成。

  還應注意，即使BEH Amide糖基分析專用柱將與甲酸銨流動相配合使用，先采用梯度和含有0.1% TFA的流動相對其活化仍非常有用。一些離子態(tài)污染物可能會強烈吸附到HILIC固定相上，TFA能夠中和這類污染物以及與其形成離子對，從而有效清洗色譜柱固定相。

g. 對新色譜柱進行基準檢查的實用性功能測試：

糖基性能測試標準品

  我們建議使用沃特世糖基性能測試標準品(部件號186006349，用于2-AB；或186007983，用于RapiFluor-MS)對新色譜柱進行基準檢查并監(jiān)測其使用過程中的性能變化。

  注：沃特世在ACQUITY UPLC BEH Amide 130?, 1.7 μm糖基分析專用柱生產(chǎn)過程中，采用部件號186006349的標準品對專為此應用設計的每批柱填料進行質(zhì)量控制測試(參見圖1的示例)。

  在本示例中，我們將100 μL的100 mM甲酸銨緩沖液(pH 4.5)和100 μL乙腈直接加入樣品瓶中，得到總體積200 μL的標準溶液。

  通過倒置輕輕混合樣品。

儲存和穩(wěn)定性

  收到標準品后，如需在溶解之前進行長期儲存，請直接將其以原包裝的形式儲存在-20℃下。溶解后之后，可將標準品等份分裝并儲存在-80℃下(最多保存3個月)或儲存在4-10℃下(為避免發(fā)生降解，保存時間不得超過一周)。應最大程度減少凍融次數(shù)。

通用色譜方法

  以下列出的條件適用于ACQUITY UPLC系統(tǒng)。如果使用ACQUITY UPLC H-Class或ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)，請使用50/50乙腈/水作為清除溶劑和清洗溶劑。所有其它條件可保持不變。

  請注意，ACQUITY UPLC H-Class和ACQUITY UPLC H-Class Bio系統(tǒng)不采用強洗針液和弱洗針液。相反，它們采用清除溶劑和清洗溶劑，兩種溶劑均應為50/50乙腈/水。

  還應當注意該應用的進樣溶劑和進樣體積。較大的糖基在含50%以上乙腈的溶液中溶解度較差。在這類條件下較大的糖基將逐漸沉淀而導致?lián)p失。然而，還應注意到，在HILIC色譜分析中，含水樣品采用較大的進樣體積時會使峰形變形。這類應用中的最佳進樣體積為<3 μL。

進樣體積：1.5 μL

進樣模式：部分定量環(huán)進樣(20 μL定量環(huán))

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7μm

糖基分析專用柱(部件號186004742)

洗脫液A：100 mM甲酸銨，pH 4.5

洗脫液B：乙腈

弱洗針液： 乙腈/HPLC級水，(90/10 v/v)

強洗針液： 乙腈/HPLC級水，(10/90 v/v)

密封清洗液： 乙腈/水(50/50，v/v)

溫度： 60 °C

檢測： 熒光：λex = 330 nm，

λem = 420 nm

  注：在本《維護和使用手冊》中，不需要使用肽針和額外的混合器來執(zhí)行分離。然而，如果這些組件在其它應用分析過程中已安裝于系統(tǒng)上，則無需將其移除。如果安裝了這些組件，N-糖的分離質(zhì)量應不受影響。

  該色譜圖是沃特世實驗室按上述方法，使用ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7 _m, 2.1 x 150 mm糖基分析專用柱獲得的典型結(jié)果。保留時間在柱長為100 mm的色譜柱上將減少33%，在柱長為50 mm的色譜柱上將減少67%，并且組分峰的分離度也將以相應的比例減小，如圖2所示。由于這些色譜柱適用于具有低死體積、耐高壓和高靈敏度的ACQUITY UPLC系統(tǒng)，因此色譜保留時間將非常接近。差異將由系統(tǒng)體積(例如混合器體積)和擴散、柱溫箱以及檢

測器流通池引起。該測試對于監(jiān)測色譜柱壽命和解決可能出現(xiàn)的分離難題具有極其重要的意義。

III. 色譜柱使用

  為了確保ACQUITY UPLC BEH糖基分析專用柱始終保持優(yōu)良性能，請遵循以下原則：

a. 樣品制備

1. 樣品中的雜質(zhì)通常會污染色譜柱。樣品在進樣到系統(tǒng)前，不應含有顆粒物質(zhì)。

2. 在大多數(shù)應用中，最好使用與初始梯度組成相同的溶劑來配制樣品。但典型的HILIC初始條件中乙腈濃度較高，而帶標記的糖基通常不能溶于高濃度乙腈中。由于是進行小體積進樣，因此樣品稀釋劑中可含有高于初始組成的水相(例如50%)。

  注：分析Waters RapiFluor-MS標記的糖基時，我們推薦使用乙腈和二甲基甲酰胺的混合物(請參見《GlycoWorks? RapiFluor-MS N糖試劑盒維護和使用手冊》部件號715004793ZH)。

3. 如果樣品不溶于流動相或本手冊中指定的溶劑組合，請確保樣品、溶劑和流動相可以混溶，以避免樣品和/或緩沖液產(chǎn)生沉淀。帶標記的糖基在制備時可能包括一步或兩步固相萃取步驟。因此，蛋白質(zhì)沉淀通常已經(jīng)被除去。否則，在>10000 rpm下離心2 min以上，除去蛋白質(zhì)顆粒。

b. pH操作限值

  ACQUITY UPLC BEH糖基分析專用柱的推薦pH操作范圍為3–8。表2中列出了常用的緩沖液和添加劑。此外，柱壽命將根據(jù)運行溫度以及使用的緩沖液類型和濃度而有所不同。

表2. 在pH 3–8范圍內(nèi)使用ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7 μm糖基分析專用柱的推薦緩沖液

c. 溶劑

  為了保持最佳的色譜柱性能，請使用優(yōu)（you）質(zhì)的色譜級溶劑。如果過濾，我們推薦使用Acrodisc®過濾器。含有懸浮顆粒物的溶劑會損壞UPLC系統(tǒng)的流路組件，并且常常會堵塞色

譜柱的入口分配濾頭。這會導致操作壓力增大，性能變差。

d. 壓力

  ACQUITY UPLC BEH糖基分析專用柱在90-100%的水性流動相中操作時，反壓將顯著上升。如圖1的梯度表所示，用100% A清洗2.1 x 150 mm糖基分析專用柱時，需要將流速降至0.25 mL/min。雖然ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7μm糖基分析專用柱能夠承受高達15000 psi(1034 bar或103 Mpa)的壓力，但為了盡可能延長色譜柱和系統(tǒng)的使用壽命，應避免壓力超過13000 psi。

  注：在極端壓力、pH和/或溫度條件下運行會導致色譜柱使用壽命縮短。

e. 溫度

  為了增強選擇性、降低溶劑粘度和提高傳質(zhì)速率，ACQUITY UPLC BEH Amide, 130?, 1.7μm糖基分析專用柱的推薦操作溫度范圍為20-90℃。但是，較高的溫度會對色譜柱壽命產(chǎn)生不

良影響，色譜柱壽命還會根據(jù)pH和緩沖液條件而有所不同。